實(shí)時熒光定量PCR原理及基礎(chǔ)知識

什么是實(shí)時熒光定量PCR (RT-PCR，qPCR)？

實(shí)時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）指的是在PCR進(jìn)行的同時，對其過程進(jìn)行監(jiān)測的能力（即實(shí)時）。因此，數(shù)據(jù)可在PCR擴(kuò)增過程中，而非PCR結(jié)束之后，進(jìn)行收集。這為基于PCR的DNA和RNA定量方法帶來了革命性的變革。在實(shí)時熒光定量PCR (qPCR)中，反應(yīng)以循環(huán)中檢測到目標(biāo)擴(kuò)增的時間點(diǎn)為特征，而非在一定循環(huán)數(shù)后目標(biāo)分子累計(jì)的擴(kuò)增量。目標(biāo)核酸的起始拷貝數(shù)越高，則會越快觀察到熒光的顯著增加。相反，終點(diǎn)法檢測（也稱 “讀板檢測”）測量的是PCR循環(huán)結(jié)束時累計(jì)的PCR產(chǎn)物量。

 

關(guān)于序列檢測試劑

概述

我們開發(fā)了兩種通過使用序列檢測系統(tǒng)（SDS）儀器進(jìn)行PCR產(chǎn)物檢測的試劑：

• Applied Biosystems™ TaqMan® 試劑（也稱“熒光5’核酸酶試劑”）
• Applied Biosystems™ SYBR™ Green I染料試劑

TaqMan方法

TaqMan方法通過采用熒光探針在PCR循環(huán)過程中隨著特定PCR產(chǎn)物的累計(jì)而對其進(jìn)行檢測。

使用TaqMan方法的檢測類型

TaqMan方法可用于以下檢測類型：
定量，包括：

• 用于RNA定量的一步法RT-PCR
• 用于RNA定量的兩步法RT-PCR
• DNA/cDNA定量
  • 等位基因檢測
  • 通過IPC進(jìn)行的正負(fù)檢測

 SYBR Green I染料試劑

SYBR Green I染料法采用了Applied Biosystems™ SYBR™ Green I染料，一種可以在PCR循環(huán)過程中隨著PCR產(chǎn)物的累計(jì)而對其進(jìn)行檢測的高度特異性雙鏈DNA結(jié)合染料。TaqMan和SYBR Green I染料法為重要的區(qū)別在于SYBR Green I染料試劑可以檢測所有雙鏈DNA，包括非特異性的反應(yīng)產(chǎn)物。因此這樣經(jīng)過特別優(yōu)化的反應(yīng)體系，對于獲取準(zhǔn)確的結(jié)果而言是非常必要的。

使用SYBR Green I染料法的檢測類型

SYBR Green I染料法可用于以下檢測類型：

• 用于RNA定量的一步法RT-PCR
• 用于RNA定量的兩步法RT-PCR
• DNA/cDNA定量

TaqMan試劑

背景

初，使用嵌入式染料進(jìn)行實(shí)時熒光PCR (qPCR) 產(chǎn)物定量。但這些染料存在重大缺點(diǎn)，即會同時檢測特異性以及非特異性PCR產(chǎn)物的擴(kuò)增量。

TaqMan方法的開發(fā)

通過引入基于Taq DNA聚合酶5’核酸酶活性的熒光標(biāo)記探針，實(shí)時定量PCR系統(tǒng)得到了顯著提升。這些熒光探針的使用，使得實(shí)時定量的方法得到了發(fā)展，實(shí)現(xiàn)了僅對特定擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測。此外，熒光標(biāo)記探針的開發(fā)，也免去了用于探針降解分析的PCR反應(yīng)后處理過程。

TaqMan序列檢測方法的工作原理

TaqMan試劑通過采用熒光探針在PCR循環(huán)過程中隨著特定PCR產(chǎn)物的累計(jì)而對其進(jìn)行檢測。工作原理：

步驟、過程

1. 構(gòu)建一段寡核苷酸探針：5’端標(biāo)記熒光染料報(bào)告基團(tuán)，3’端標(biāo)記淬滅染料基團(tuán)。當(dāng)探針保持完整時，淬滅基團(tuán)的靠近會通過空間上的熒光共振能力轉(zhuǎn)移（FRET）而顯著降低由報(bào)告染料基團(tuán)發(fā)射的熒光。
2. 如果存在目標(biāo)序列，探針便會在其中一個引物結(jié)合位點(diǎn)的下游發(fā)生退火，并隨著引物的延伸通過Taq DNA聚合酶的5’核酸酶活性，完成切除。
3. 探針的切除將會引起：
   • 將報(bào)告染料基團(tuán)和淬滅染料基團(tuán)進(jìn)行分離，增強(qiáng)了報(bào)告染料基團(tuán)的信號。
   • 將探針從目的鏈上去除，使引物繼續(xù)沿模板鏈末端延伸。因此，探針的介入并不會抑制整個PCR過程。
4. 每經(jīng)過一個循環(huán)，就會有更多的報(bào)告基因染料分子從各自的探針上切斷，熒光強(qiáng)度會隨著合成的擴(kuò)增片段數(shù)量的增加而增加。



兩種類型的 TaqMan 探針

我們可提供兩種類型的Applied Biosystems™ TaqMan® 探針：

• TaqMan探針（含有Invitrogen™ TAMRA™染料——淬滅染料基團(tuán)）
• Applied Biosystems™ TaqMan® MGB探針

推薦用于等位基因檢測的 TaqMan MGB 探針

我們一般推薦使用TaqMan MGB探針進(jìn)行等位基因分型分析，特別是當(dāng)傳統(tǒng)TaqMan探針超過30個核苷酸時。TaqMan MGB探針包含：

• 位于3 '端的非熒光淬滅基團(tuán)——由于淬滅基團(tuán)不發(fā)出熒光，因此SDS儀可以更地檢測出報(bào)告基因染料 。
• 位于3’ 端的小溝結(jié)合物 – 小溝結(jié)合物可提高探針的熔解溫度（Tm），縮短探針的長度。

終，TaqMan MGB 探針會在匹配和未匹配探針之間展現(xiàn)出更大的 Tm 值差異，從而提供更準(zhǔn)確的等位基因分型。

TaqMan 方法的優(yōu)點(diǎn)

TaqMan方法的優(yōu)點(diǎn)如下：

• 需要在探針和目標(biāo)分子（靶點(diǎn)）之間發(fā)生特異性的水解（雜交），方可生成熒光信號
• 您可使用明顯不同的報(bào)告基因染料標(biāo)記探針，在一個反應(yīng)管內(nèi)擴(kuò)增并檢測兩個不同的序列
• 無需PCR后處理，減少分析工作量并節(jié)省材料成本。

TaqMan方法的缺點(diǎn)：

TaqMan方法的主要缺點(diǎn)在于需要根據(jù)不同的序列，合成不同的探針。

 

SYBR Green I染料試劑

背景

一般將可與雙鏈DNA發(fā)生結(jié)合的小分子分為以下兩類：

• 嵌入劑
• 小溝結(jié)合物

無論哪種結(jié)合方法，用于PCR實(shí)時檢測的DNA結(jié)合染料都需要滿足以下兩個條件：

• 結(jié)合至雙鏈DNA時，會有增強(qiáng)的熒光
• 對 PCR 不會產(chǎn)生抑制

我們開發(fā)更加優(yōu)化的條件，使得SYBR Green I染料的使用不會對PCR產(chǎn)生抑制并帶來相對于溴化乙錠更為靈敏的檢測。

SYBR Green I染料法的工作原理

SYBR Green I染料法通過SYBR Green I染料與PCR過程中產(chǎn)生的雙鏈DNA結(jié)合，而對聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）的產(chǎn)物進(jìn)行檢測。工作原理：

步驟、過程

當(dāng)SYBR Green I染料被加入到樣品中后，它可立即與樣品中的雙鏈DNA進(jìn)行結(jié)合 。

1. 在PCR過程中，Applied Biosystems™ AmpliTaq Gold™DNA聚合酶可對目標(biāo)序列進(jìn)行擴(kuò)增，以產(chǎn)生PCR產(chǎn)物，即“擴(kuò)增子”。
2. 隨后，SYBR Green I染料會與每一個新產(chǎn)生的雙鏈DNA分子進(jìn)行結(jié)合。
3. 隨著PCR的進(jìn)行，越來越多的擴(kuò)增子被生成。由于SYBR Green I染料可與所有的雙鏈DNA結(jié)合，因此熒光強(qiáng)度也會隨著PCR產(chǎn)物的增加而增加。

SYBR Green I染料法的優(yōu)點(diǎn)

SYBR Green I染料法的優(yōu)點(diǎn)如下：

• 它可用于監(jiān)測任何雙鏈 DNA 序列的擴(kuò)增。
• 無需探針，降低了檢測的設(shè)置和運(yùn)行成本。

SYBR Green I染料法的缺點(diǎn)：

SYBR Green I染料法的大缺點(diǎn)在于可能會產(chǎn)生假陽性信號；即，因?yàn)镾YBR Green I染料可與任何的雙鏈DNA發(fā)生結(jié)合，因此也會與非特異性的雙鏈DNA序列發(fā)生結(jié)合。

其他注意事項(xiàng)

采用DNA結(jié)合染料的另一原因，是多重染料與單一擴(kuò)增分子的結(jié)合。這可提高擴(kuò)增產(chǎn)物檢測的靈敏度。基于多重染料的結(jié)合，將迎來信號量取決于在反應(yīng)中所產(chǎn)生的雙鏈DNA量的局面。因此，如果擴(kuò)增效率相同，相較于對較短產(chǎn)物的擴(kuò)增，對較長產(chǎn)物的擴(kuò)增將會產(chǎn)生更多的信號。這*不同于熒光探針，使用熒光探針時，對于每個合成的擴(kuò)增分子淬滅僅釋放一個熒光基團(tuán)，與其長短并不相關(guān)。

 

關(guān)于定量檢測

什么是定量檢測？

定量檢測是一種實(shí)時的PCR (qPCR) 檢測。測量（定量）每輪PCR擴(kuò)增循環(huán)中，檢測目標(biāo)核酸片段的量。目標(biāo)分子可以為DNA、cDNA或RNA。此方法指南主要對以下三種定量檢測進(jìn)行討論：

• DNA/cDNA定量
• 采用一步法逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）的RNA定量
• 采用兩步法RT-PCR的RNA定量

定量分析常見術(shù)語

擴(kuò)增子：PCR過程而產(chǎn)生的DNA短片段
擴(kuò)增曲線：根據(jù)熒光信號相對于循環(huán)數(shù)而制作的曲線
基線：PCR起始時，熒光信號還未發(fā)生變化的幾個循環(huán)
Ct（閾值循環(huán)）：熒光信號超過NTC（無模板對照樣品）固定閾值時的循環(huán)數(shù) 。用于對擴(kuò)增質(zhì)量進(jìn)行驗(yàn)證。
核酸目標(biāo)：（也稱為“目標(biāo)模板”）——需要擴(kuò)增的DNA或RNA序列
惰性參比染料： 一種可作為內(nèi)部對照，以用于在數(shù)據(jù)分析時對報(bào)告基團(tuán)染料信號進(jìn)行均一化的染料。均一化是對因濃度或體積變化而隨之引起波動進(jìn)行的必要校正。所有的SDS PCR試劑盒都提供了參比熒光對照。
Rn（均一化報(bào)告基團(tuán)）：報(bào)告基團(tuán)染料釋放的熒光強(qiáng)度除以惰性參比染料釋放的熒光強(qiáng)度
Rn+: 一次反應(yīng)的Rn值包含所有的組分，包括模板
Rn-：未反應(yīng)樣品的Rn值。Rn值可通過以下方式獲取：

• 實(shí)時熒光定量PCR (qPCR) 運(yùn)行的早期循環(huán)（產(chǎn)生可被檢測的熒光信號之前的循環(huán)），或
• 不含有任何模板的反應(yīng)

ΔRn (delta Rn): 在特定PCR條件設(shè)置下所產(chǎn)生的信號量級。
ΔRn可通過以下公式計(jì)算：(Rn+) – (Rn-)標(biāo)準(zhǔn)品 具有已知濃度的A樣本，用于繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。通過使用不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，您可構(gòu)建用于未知樣品定量分析的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
閾值：早期PCR循環(huán)時Rn值的平均標(biāo)準(zhǔn)差，乘以相應(yīng)的校正系數(shù)閾值應(yīng)當(dāng)設(shè)定在PCR指數(shù)擴(kuò)增時的相關(guān)區(qū)域。
未知：具有未知模板量的樣品。即，您需要進(jìn)行檢測的樣品。

實(shí)時PCR (qPCR) 定量檢測工作原理

在PCR的起始循環(huán)中，熒光信號幾乎不發(fā)生變化。從而定義為擴(kuò)增曲線中的基線。而超出基線部分的熒光的增加，則為對累計(jì)目標(biāo)分子的檢測。固定的熒光閾值線，可設(shè)置在基線之上。熒光超過固定閾值時的循環(huán)數(shù)則為參數(shù)CT（閾值循環(huán)）。

 

與相對定量

概述

當(dāng)對定量檢測的結(jié)果進(jìn)行計(jì)算時，可以采用或相對定量。

什么是定量？

定量檢測是根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知樣品進(jìn)行的定量。

示例

定量可根據(jù)病毒的拷貝數(shù)，監(jiān)控疾病狀態(tài)。研究者須知道特定生物學(xué)樣品中目標(biāo)RNA分子的準(zhǔn)確拷貝數(shù)，以對疾病的進(jìn)展進(jìn)行監(jiān)測。定量可通過從所有SDS儀器獲取的數(shù)據(jù)進(jìn)行，但注意標(biāo)準(zhǔn)品的定量則須首先通過其他方法獲取。

什么是相對定量？

相對定量用于分析特定樣品相對于參照樣品（比如，未處理的對照組）某個基因表達(dá)量的變化。

示例

相對定量可用于檢測化合物（藥物）引起的基因表達(dá)改變。經(jīng)化學(xué)處理樣品中的特定目標(biāo)基因的表達(dá)水平可與相對未處理樣品中的基因表達(dá)水平進(jìn)行比較。

相對定量的計(jì)算方法

相對定量可根據(jù)從所有SDS儀器獲取的數(shù)據(jù)而進(jìn)行。用于相對定量的計(jì)算方法有：

• 標(biāo)準(zhǔn)曲線法
• 比較CT法

確定使用哪種方法 所有方法都可產(chǎn)生同等的結(jié)果。當(dāng)在確定使用哪種方法時，需要注意：

• 在不同的反應(yīng)管中進(jìn)行目標(biāo)分子和內(nèi)源性對照的擴(kuò)增時，采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行分析，所需優(yōu)化和驗(yàn)證操作少。
• 采用比較CT法時，則須進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，以表明目標(biāo)分子和內(nèi)源性對照擴(kuò)增的效率基本相同。比較CT法的優(yōu)勢在于無需標(biāo)準(zhǔn)曲線，從而可以實(shí)現(xiàn)通量提高（因?yàn)闊o需額外的孔用于標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制）；并消除在進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制時因稀釋錯誤所帶來的不利結(jié)果。
• 如需將靶標(biāo)和內(nèi)源性對照品在同一管內(nèi)進(jìn)行擴(kuò)增，則須優(yōu)化并限制引物的濃度以避免對 CT 值產(chǎn)生影響。當(dāng)在一管中進(jìn)行雙重反應(yīng)時，可以提高通量并減少移液失誤所帶來的不利影響。

常用術(shù)語

和相對定量中常用的術(shù)語，如下：

標(biāo)準(zhǔn)：用于構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線的已知濃度樣品。
參考文獻(xiàn)：用于對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行均一化的陰性或陽性信號。內(nèi)源性和外源性對照是常見的陽性對照。陽性對照指的是因 PCR擴(kuò)增 而產(chǎn)生的信號。陽性對照則具有自己的引物和探針組合。
內(nèi)源性對照：指的是，在每個樣品進(jìn)行提取時便已存在于樣品中的RNA或DNA。當(dāng)采用內(nèi)源性對照作為陽性對照時，您可通過對信使RNA（mRNA）的均一化定量來消除每次反應(yīng)中加入的總RNA量的差異。
外源性對照：指的是，在每個樣品中加入的具有已知濃度的特殊RNA或DNA。外源性陽性對照通常是來自可以作為內(nèi)部陽性對照（IPC）的體外成分，可區(qū)分真正的目標(biāo)陰性和PCR抑制。此外，外源性對照還可均一化樣品提取或逆轉(zhuǎn)錄中互補(bǔ)DNA（cDNA）合成的效率差異。無論是否使用陽性對照，使用含有ROX染料的參比熒光對照都是十分重要的，因?yàn)樗梢詫Ψ荘CR相關(guān)的熒光信號波動進(jìn)行均一化。
目標(biāo)分子的均一化量：一個可以用于比較不同樣品中目標(biāo)分子相對量的無單位數(shù)字。
校準(zhǔn)品：可以用作比較結(jié)果基礎(chǔ)的樣品。

 

用于相對定量的標(biāo)準(zhǔn)曲線法

概述

因采用的是相對于基礎(chǔ)樣品的表達(dá)量，例如校準(zhǔn)品，用于相對定量的標(biāo)準(zhǔn)曲線一般都比較容易繪制。對于所有的實(shí)驗(yàn)樣品，其目標(biāo)分子的量均是從標(biāo)準(zhǔn)曲線獲取，然后除以校準(zhǔn)品的目標(biāo)分子量而確定的。因此，校準(zhǔn)品便成為1 X 樣品，而所有其他的量則都為以n倍校準(zhǔn)品來表示。例如，在研究藥物對表達(dá)產(chǎn)生的影響時，未處理的對照樣品便是合理恰當(dāng)?shù)男?zhǔn)品。

關(guān)鍵指南

以下指南可為相對定量中標(biāo)準(zhǔn)曲線的正確使用，提供關(guān)鍵指導(dǎo)：

• RNA或DNA儲存液的準(zhǔn)確稀釋是十分重要的，但用于表達(dá)稀釋的單位是無關(guān)的。如果對來自對照細(xì)胞系的總RNA進(jìn)行了2倍的稀釋后進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制，則單位應(yīng)該是稀釋值1、0.5、0.25、0.125等。如果使用相同的 RNA 或 DNA 儲存液進(jìn)行不同板上的標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制，則可在不同板之間比較確定的相對定量。
• 也可使用DNA標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行RNA的相對定量。這么做需要假設(shè)目標(biāo)分子在所有樣品中的逆轉(zhuǎn)錄效率都是相同的，但并不需要知道效率的值。
• 在采用內(nèi)源性對照進(jìn)行定量均一化時，應(yīng)該對目標(biāo)分子和內(nèi)源性對照都進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。對于每一個實(shí)驗(yàn)樣品，目標(biāo)分子和內(nèi)源性對照的量都是根據(jù)合適的標(biāo)準(zhǔn)曲線而確定的。因此，目標(biāo)分子的量除以內(nèi)源性對照的量便是均一化后的目標(biāo)分子值。同樣的，其中的一個實(shí)驗(yàn)樣品便是校準(zhǔn)品，或1×樣品。每一個均一化的目標(biāo)分子值除以校準(zhǔn)品的均一化值后便是相對的表達(dá)水平。

內(nèi)源性對照

對于內(nèi)源性對照進(jìn)行擴(kuò)增可用于對加入至反應(yīng)的樣品RNA或DNA的量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。對于基因表達(dá)定量，研究者采用過 ß-肌動蛋白、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）、核糖體RNA（rRNA）或其他RNA作為內(nèi)源性對照。

標(biāo)準(zhǔn)品

由于樣品量會除以校準(zhǔn)品的量，則標(biāo)準(zhǔn)曲線中的單位便被去除了。因此，對于標(biāo)準(zhǔn)品來說所有需要知道的只是它們的相對稀釋比。對于相對定量，任何含有合適目標(biāo)分子的RNA或DNA儲存液都可用作標(biāo)準(zhǔn)品。

 

用于相對定量的比較CT法

比較CT法與標(biāo)準(zhǔn)曲線法相似，只是它利用的是算術(shù)公式2−ΔΔCT來獲取相同的相對定量結(jié)果。

算術(shù)公式：

為了有效地利用比較 CT 法，目標(biāo)分子（基因）和對照（內(nèi)源性對照）的擴(kuò)增效率應(yīng)當(dāng)近似相同。 
更多關(guān)于使用比較CT法進(jìn)行相對定量的信息，請參閱用戶手冊#2：基因表達(dá)的相對定量（PN4303859）。

 

用于定量的標(biāo)準(zhǔn)曲線法

概述

用于定量的標(biāo)準(zhǔn)曲線法與用于相對定量的標(biāo)準(zhǔn)曲線法類似，只是標(biāo)準(zhǔn)品的量必須首先通過其他獨(dú)立方法獲取。

關(guān)鍵指南

下面的指南對于定量中標(biāo)準(zhǔn)曲線的正確使用十分關(guān)鍵：

• 來自單一、純凈物種的DNA或RNA是十分重要的。例如，從大腸桿菌制備的質(zhì)粒DNA通常都會存在RNA的污染，這會增加A260的讀數(shù)而增加質(zhì)粒的拷貝數(shù)計(jì)算結(jié)果。
• 準(zhǔn)確的移液是必需的因?yàn)闃?biāo)準(zhǔn)品需要經(jīng)過不同的數(shù)量級的順序稀釋。質(zhì)粒DNA或體外轉(zhuǎn)錄的RNA必須被濃縮以便獲取準(zhǔn)確的A260測量值。濃縮的DNA或RNA隨后必須被稀釋106–1012倍以獲得與生物學(xué)樣品中目標(biāo)分子相似的濃度。
• 稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品的穩(wěn)定性也需要引起注意，特別是對于 RNA。將稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品分裝至多份，儲存在-80°C，并僅在使用前才進(jìn)行解凍。

 無法使用DNA作為RNA定量的標(biāo)準(zhǔn)品，因?yàn)閷τ谀孓D(zhuǎn)錄過程的效率沒有對照。

標(biāo)準(zhǔn)品

標(biāo)準(zhǔn)品的量必須首先通過其他獨(dú)立的方法獲取。質(zhì)粒 DNA 和體外轉(zhuǎn)錄的 RNA 通常用于制備標(biāo)準(zhǔn)品。濃度可在A260 處被測量得到，并通過使用DNA或RNA的分子量轉(zhuǎn)化成拷貝數(shù)。